Um Programa que Facilita a Selecção de Oligonucleotides para Site-Directed Mutagenesis

Resumo

Site-directed mutagenesis is a powerful tool that has enabled molecular biologists to perform functional analysis of altered nucleic acids and proteins 3 . - Site direcionado mutagênese é uma poderosa ferramenta que permitiu biólogos moleculares para realizar análise de ácidos nucleicos modificado e proteínas 3. Newer PCR-based mutagenesis techniques have reduced the process of mutagenesis to as little as one day 2 . Recentes PCR-baseado mutagênese técnicas têm reduzido o processo de mutagênese para tão pouco como um dia 2. While each technique has its advantages, both require a strategy to isolate the desired clone from a population that contains mutagenized and wild type genes. Embora cada técnica tem suas vantagens, ambas requerem uma estratégia para isolar o desejado clone de uma população que contém mutagenized e selvagens tipo genes. In this report, we describe a World Wide Web-based computer program that facilitates the design of mutagenic primers such that successfully mutagenized clones can be identified by the presence or absence of a unique restriction site. Neste relatório, que descrevem um World Wide Web baseado em computador o programa que facilita a concepção de que o sucesso dessa mutagénicas primers mutagenized clones podem ser identificados pela presença ou ausência de uma única restrição site.

Introduction Introdução

Many site directed mutagenesis protocols call for the use of two oligonucleotides 5 . Muitos mutagénese dirigida protocolos apelo à utilização de dois oligonucleótidos 5. The mutagenic oligonucleotide introduces the desired mutation and a selection oligonucleotide increases the fraction of successfully mutagenized clones and facilitates their subsequent identification. O mutagénicas oligonucleotide introduz o desejado mutação e uma selecção oligonucleotide aumenta a fração de sucesso mutagenized clones e facilita a sua posterior identificação. The selection oligonucleotide does improve the fraction of mutagenized clones but it is not 100% effective 3 . A selecção oligonucleotide faz melhorar a fração de mutagenized clones, mas não é 100% eficaz 3. Clones to which the selection oligonucleotide but not the mutagenic oligonucleotide has annealed are only identified with subsequent DNA sequencing. Clones para que a selecção oligonucleotide mas não o mutagénicas oligonucleotide tem annealed só são identificados com posterior DNA sequenciamento.

If the mutagenic primer introduces or deletes a restriction site, then it can aid in the subsequent identification of mutagenized clones. Se o mutagénicas primer introduz ou elimina uma restrição site, então ele pode auxiliar na posterior identificação dos mutagenized clones. In effect, the mutagenic primer can be carefully designed to also be a selective primer. Com efeito, o primer mutagénicas podem ser cuidadosamente concebida para ser também um selectiva primer. The Primer Generator automates the selection of a mutagenic oligonucleotide that meets these criteria. A Primer Generator automatiza a selecção de um mutagénicas oligonucleotide que satisfaz estes critérios. This technique, of carefully selecting a mutagenic oligonucleotide to facilitate subsequent mutant identification, is a useful and cost effective method for optimizing the procedure of site directed mutagenesis. Esta técnica, de uma cuidadosa selecção mutagénicas oligonucleotide para facilitar a posterior identificação mutante, é um método útil e rentável para otimizar o processo de mutagénese dirigida.

Materials and Methods Materiais e Métodos

Software

The following software is used: Perl 10 with a CGI module 9 and NCSA HTTPd server 6 . O software é utilizado seguintes: Perl 10 com um módulo CGI 9 e NCSA HTTPd servidor 6.

Algorithm Algoritmo

An outline of the program can be seen in figure 1 . Um esboço do programa pode ser visto na figura 1. Initially, the investigator inputs the nucleotide sequence encoding the current protein fragment and the protein sequence desired following mutagenesis. Inicialmente, o investigador insumos a seqüência nucleotídica codifica a proteína atual fragmento e as proteínas seqüência desejada seguintes mutagênese. The latter sequence is reverse translated using the redundancy of the genetic code to produce a number of DNA sequences that could potentially encode the given protein sequence. A última seqüência reversa é traduzida usando a redundância do código genético para produzir uma série de sequências ADN que poderiam codificar a proteína dada seqüência.

Following reverse translation, the sequences are interrogated for restriction enzyme sites using data from The Restriction Enzyme Database (REBASE) at http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html . Após a tradução reversa, as seqüências são interrogadas pela restrição enzima sites usando dados de A Restrição Enzimática Database (REBASE) no http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html. The results of these searches are independently compiled for the current and all possible target nucleotide sequences. Os resultados dessas pesquisas são autonomamente elaboradas para todos os actuais e possível alvo nucleotídeo seqüências. Potential restriction sites in the existing sequence are subtracted from restriction sites in the mutagenized sequence thereby generating a list of restriction sites unique to the mutagenized product. Potencial restrição sites existentes na seqüência são subtraídos dos restrição sites na seqüência mutagenized gerando assim uma lista de sites única restrição à mutagenized produto. Similarly, restriction sites in the mutagenized sequence are subtracted from restriction sites in the existing sequence which identifies sites that were deleted by the mutagenesis procedure. Do mesmo modo, restrição sites na seqüência mutagenized são subtraídos dos restrição sites existentes na seqüência que identifica sites que foram suprimidos pelo mutagênese procedimento.

From these operations, a list of unique restriction sites in the mutagenized sequence and the oligonucleotide probes needed to generate them is compiled. A partir dessas operações, uma lista de sites única restrição no mutagenized seqüência e as sondas oligonucleotide necessário para gerá-los é compilado. In addition, restriction sites that are deleted from the existing sequence through the mutagenesis procedure are also listed. Além disso, a restrição sites que são suprimidos da seqüência existente através da mutagênese procedimento também estão listadas.The mutagenic primer output is ordered by increasing number of base pairs that differ from the original sequence. A saída é mutagénico primer ordenados pelo número crescente de base pares que diferem da seqüência original. These base pairs are boldfaced. Estes base pares são boldfaced. A useful feature of the pPrimer gGenerator is the ability to limit the output by the maximal number of substitutions that will be tolerated in the mutagenic primer. Uma característica útil do pPrimer gGenerator é a capacidade de restringir a saída pelo máximo número de substituições que serão toleradas no mutagénicas primer. It can be set for 1 through 10 or for no limit. Pode ser definido para 1 a 10 ou de qualquer limite. This feature facilitates selection of a mutagenic primer that necessitates minimal alteration of the existing sequence. Esse recurso facilita a selecção de um mutagénicas primer que requer mínima alteração da actual seqüência. To decrease computation time, especially for longer sequences, it is also possible to limit the number of restriction endonucleases to only the most commonly used enzymes. Para diminuir o tempo computação, em especial para os mais seqüências, também é possível limitar o número de endonucleases de restrição apenas os mais comumente utilizados enzimas. These enzymes are likely to be readily available in most laboratories. Estas enzimas são susceptíveis de ser prontamente disponível na maioria dos laboratórios.

Introducing or deleting a unique restriction site may necessitate mutagenizing more than the minimal number of residues required to elicit the desired change in primary sequence. A introdução ou apagar uma única restrição site mutagenizing pode exigir mais do que o número mínimo de resíduos necessárias para obter a mudança desejada na seqüência primária. The mutagenesis procedure is sufficiently robust however to facilitate changing more than one base pair. A mutagênese procedimento é suficientemente robusto para facilitar a mudança no entanto mais do que uma base par. A mutagenic oligonucleotide may also be chosen such that it introduces a unique restriction site in the mutagenized sequence, deletes a specific restriction site from the existing sequence or produces some combination of the two. Um mutagénicas oligonucleotide também podem ser escolhidos de modo que ela introduz uma única restrição no site mutagenized seqüência, suprime um determinado site da restrição existente seqüência produz ou uma combinação dos dois. A number of clones from the mutagenesis procedure can then be screened in a short amount of time with a restriction digest prior to being sequenced. Um certo número de clones da mutagênese procedimento pode, então, ser examinado em um curto período de tempo com uma restrição digerir antes de ser faseada.

The restriction enzymes’ names in the output are linked to the corresponding entries in the REBASE database which provides the user with additional information about the enzyme. A restrição enzimas dos nomes na saída estão ligados à entradas correspondentes no REBASE base, que prevê que o usuário com informações adicionais sobre a enzima. Included among this information is enzyme type, microorganism from which it was isolated, the prototype of the enzyme (the isoschizomer that was discovered first), the recognition sequence, the sites at which the DNA strand is cleaved, commercial sources of the enzyme and references pertaining to the discovery and characterization of the enzyme. Incluído entre este tipo de informação é enzima, a partir de microrganismos, que foi isolado, o protótipo da enzima (isoschizomer que foi descoberto o primeiro), o reconhecimento seqüência, os sites em que o ADN é cleaved vertente, fontes comerciais e referências da enzima Pertencente à descoberta e caracterização da enzima.

Results Resultados

To demonstrate the effectiveness of this algorithm, we asked the program to develop primers that mutagenize a critical serine residue in the Rapamycin Rapamycin And And FKBP12 FKBP12 Target Target protein 1 (RAFT1) to arginine. Para demonstrar a eficácia deste algoritmo, que pediu o programa para desenvolver primers que mutagenize forma crítica serina resíduo na Rapamycin Rapamycin E FKBP12 FKBP12 Target Target proteína 1 (RAFT1) para arginina.When administered to cells, rapamycin forms a complex with the immunophilin FKBP12. Quando administrada a células, rapamycin forma um complexo com o immunophilin FKBP12.This complex subsequently interacts with RAFT1 8 /FRAP 1 . Este complexo posteriormente interage com RAFT1 8 / FRAP 1. This FKBP12-rapamycin-RAFT1 interaction is dependent on the presence of a serine residue at position 2035 in RAFT1/FRAP 1 . Este FKBP12-rapamycin-RAFT1 interação é dependente da presença de um resíduo serina na posição 2035, em RAFT1/FRAP 1. RAFT1/FRAP mutants that do not complex with FKBP12 in the presence of rapamycin are proving instrumental in elucidating the signaling capacity of this protein. RAFT1/FRAP mutantes que não complexo, com FKBP12 na presença de rapamycin estão provando instrumental em elucidar a sinalização capacidade desta proteína. The output of the program is summarized in figure 2 . A saída do programa é resumido na figura 2.

The output in figure 2 is only a representative selection of the entire output of the program which included 15 different mutagenic oligonucleotides. A saída na figura 2 é apenas uma selecção representativa de toda a produção do programa, que incluiu 15 diferentes mutagénicas oligonucleótidos. The mutagenic oligonucleotides (limited to the maximum of three substitutions compared to the original sequence) are capable of introducing 14 unique restriction sites, deleting the 5 existing sites and allowing the user to select from combinations thereof. O mutagénicas oligonucleótidos (limitada ao máximo de três substituições, em comparação com a seqüência inicial) são capazes de introduzir 14 única restrição sites, eliminando os 5 sites existentes e que permite ao usuário selecionar a partir de combinações. Alternatively, with settings changed to limit restriction endonucleases used in analysis only to the most common enzymes, and the maximum number of substitutions raised to four, we are still able to introduce six new and remove two old restriction sites (data not shown). Alternativamente, com definições alteradas para limitar a restrição endonucleases utilizados na análise apenas para a mais comum das enzimas, bem como o número máximo de substituições aumentado para quatro, que ainda são capazes de introduzir seis novos e remover duas velhas restrição sites (dados não apresentados).

Discussion Discussão

The Primer Generator has a number of uses. A Primer Generator tem um certo número de utilizações. For example, an approach that has been used to define the binding specificities of modular protein-protein interaction domains such as the phosphotyrosine directed SH3 domain is to independently vary the amino acid residue at a single position to the other 19 amino acids 7 . Por exemplo, uma abordagem que tem sido utilizado para definir as especificidades de carácter vinculativo modular proteína-proteína interação domínios como a phosphotyrosine dirigida SH3 domínio está a variar independentemente do aminoácido resíduo em uma posição única para os restantes 19 aminoácidos 7. This method has been successful in defining the binding characteristic of a single position (hydrophobic, basic, etc.) in the target peptide. Este método tem sido bem sucedido na definição do carácter vinculativo característica de uma posição única (hidrofóbicos, basic, etc) no alvo peptídeo. By using the Primer Generator, one could order a single mutagenic primer that contains 3 N’s in place of the codon that is to be mutated as well as an N’s in the wobble position of the adjacent invariant codons (over a thousand different sequences). Ao usar o Primer Generator, pode-se encomendar uma única mutagénicas primer que contém 3 N’s, em substituição do códão que está a ser mutado, bem como uma N’s no wobble posição do adjacentes invariante codões (mais de um milhar de diferentes sequências) . A single mutagenesis reaction would be performed, and a few well chosen restriction digests would rapidly identify the desired mutants while preventing the sequencing of redundant mutants. Um único mutagênese reacção seria realizada, e alguns bem escolhidos restrição digere iria identificar rapidamente o desejado mutantes, evitando o seqüenciamento de mutantes redundantes.

In addition to its use for mutagenesis, the pPrimer gGenerator can also be of use in clinical settings. Além de seu uso para mutagênese, o pPrimer gGenerator também podem ser de uso em clínicas. A number of genetic diseases such as cystic fibrosis are characterized by a specific mutation that accounts for greater than 70% of all cases 101 . Uma série de doenças genéticas, como a fibrose cística são caracterizados por uma mutação específica que responde por mais de 70% de todos os casos 101. If one wished to screen PCR products generated by primers flanking the region most commonly mutated, they need only input the wild type and mutant sequences into the program to find restriction enzymes that can be used to distinguish between the two. Se um quis tela PCR produtos gerados pelos primers acompanhamento a região mais comumente mutado, eles só precisam de entrada do tipo selvagem e mutante sequências no programa para encontrar restrição enzimas que pode ser usado para distinguir entre os dois.

Computers are assuming an ever increasing role in molecular biology. Os computadores estão assumindo um papel cada vez maior na biologia molecular. The repertoire of computer-based tools and utilities available to investigators continues to grow. O repertório de computador baseado em ferramentas e utilitários disponíveis para os investigadores continuam a crescer.Here we report an algorithm that allows one to choose a mutagenic oligonucleotide such that successfully mutated DNA can readily be identified via a restriction digest. Aqui mostramos um algoritmo que permite uma escolha uma mutagénicas oligonucleotide DNA mutado com sucesso tal que possa ser facilmente identificado através de uma restrição digerir. The flexible, user friendly interface offers the user extensive control of the program and its output. O flexível, user friendly interface oferece ao usuário uma extensa controle do programa e sua saída. The hot links provide the user with additional information about the enzyme chosen. O hot links fornecem o usuário com informações adicionais sobre a enzima escolhida. The availability of site-specific, hybrid restriction endonucleases is expected to increase the number of enzymes available for use by this program 4 . A disponibilidade do site-específico, híbrido restrição endonucleases espera-se que aumente o número de enzimas disponíveis para utilização por este programa 4. A carefully chosen mutagenic oligonucleotide can save time and money by reducing the number of primers used and clones sequenced. Um cuidadosamente escolhidos mutagénicas oligonucleotide pode poupar tempo e dinheiro através da redução do número de primers utilizados e clones seqüenciados. The Primer Generator can be accessed at http://www.med.jhu.edu/medcenter/primer/primer.cgi A Primer Generator podem ser acessadas no

Acknowledgments Agradecimentos

The authors wish to thank Dr. Robert Cottingham and Dr . Peter Li for constructive feedback and technical comments. Os autores querem agradecer ao Dr. Robert Cottingham e Dr. Peter Li para feedback construtivo e técnicos comentários. We are also indebted to the Division of Biomedical Information Sciences of the Johns Hopkins University School of Medicine for allotting the project free space on the JHMI Affiliates Server. Estamos também a dívida para com a Divisão de Informação Ciências Biomédicas da Universidade Johns Hopkins School of Medicine da outorga de o projecto de espaço livre no JHMI Afiliados Server.

pagina traduzida ;)

Fonte: http://www.med.jhu.edu

Creditos: Dr O.liverkall (:

Um Programa que Facilita a Selecção de Oligonucleotides para Site-Directed Mutagenesis Um Programa que Facilita a Selecção de Oligonucleotides para Site-Directed Mutagenesis Reviewed by Kembolle Amilkar on domingo, novembro 09, 2008 Rating: 5

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