Genotipagem para HIV


(os ponto pretos São o virus da aid's)

Recentes avanços nos estudos sobre o HIV-1 voltados, principalmente, para a quantificação da carga viral em plasma e células mononucleares do sangue periférico de pacientes nos diferentes estágios da síndrome de imunodeficiência adquirida (AIDS) têm evidenciado que a infecção pelo HIV-1 é um processo dinâmico, em que ocorre um equilíbrio entre a produção e a eliminação de partículas virais. Esse processo é observado, inclusive, na fase de latência clínica, caracterizada por ausência de sintomas, altos níveis de anticorpos circulantes e níveis baixos ou não-detectados de viremia. A associação à elevada taxa de mutação genômica do HIV-1 resulta no desenvolvimento de linhagens virais mutantes, que são mais eficazmente selecionadas sob condições de pressão seletiva exercida pelo sistema imunológico ou pela intervenção farmacológica prolongada.

Essas variantes HIV-1 não são reconhecidas pelos mecanismos imunes efetores (anticorpos neutralizantes e/ou linfócitos T citotóxicos) e podem apresentar mutações nos genes codificantes para as enzimas protease ou transcriptase reversa. Estas resultam em mutações de aminoácidos nas enzimas, selecionando, desta forma, variantes resistentes aos anti-retrovirais.

Mutações no genoma do HIV que conferem resistência aos agentes anti-retrovirais têm sido relatadas para todos os compostos usados no tratamento de pacientes infectados. O início da infecção está associado a uma população homogênea de HIV que é, usualmente, sensível aos anti-retrovirais. No entanto, as altas taxas de mutação podem resultar em 106 variantes genéticas, entre as quais podem estar presentes, em baixos níveis, as resistentes aos anti-retrovirais, antes do início da terapia.

O significado clínico da resistência aos anti-retrovirais não está ainda totalmente elucidado, porém atribui-se a ocorrência ao decréscimo na eficiência da quimioterapia anti-retroviral.

A enzima transcriptase reversa é estudada mais extensamente para a intervenção farmacológica. Ela é essencial para a replicação do HIV-1, uma vez que a expressão das proteínas virais e a progênie viral dependem da conversão da cadeia simples de RNA em cadeias duplas de DNA e subseqüente integração do cDNA viral ao genoma da célula hospedeira.

Análogos dos inibidores nucleosídicos da transcriptase reversa 3′-azido-3′-desoxitimidina (AZT; zidovudina); 2′,3′-didesoxinosina (ddI; didanosina); 2′,3′-didesoxicitidina (ddC; zalcitabina); (-)-b-L- 2′,3′-didesoxi-3′-tiacitidina (3TC; lamivudina) e 2′,3′-didesidro-3′-desoxitimidina (d4T; estavudina) são as drogas atualmente aprovadas para o tratamento da AIDS. Esses compostos atuam de modo semelhante, após ativação metabólica por fosforilação efetuada por quinases intracelulares. As formas trifosfato resultantes podem inibir a enzima transcriptase reversa por competição pelo substrato ou podem atuar como cadeias finais da reação de transcrição reversa, inibindo a síntese do cDNA viral.

As mutações de resistência são divididas em primárias e secundárias. As primárias devem ser analisadas em separado, já que são diretamente responsáveis pela diminuição acentuada na sensibilidade à droga. Para utilização adequada da genotipagem para HIV-1 é necessário uma avaliação criteriosa dos resultados.

As alterações nos códons abaixo podem definir resistência total ou parcial às medicações anti-retrovirais.
Inibidores de transcriptase reversa análogos de nucleosídeos
- T215YF, M41L, K70R, D67N, L210W, K219Q, M184VI, V1181, E44D, K65R, L74V, Y115F.

Inibidores de transcriptase reversa não-análogos de nucleosídeos
- K103N, V106A, V1081, Y181CI, Y188CLH, G190AS, P236L, L1001.

Inibidores de protease
- M461L, V82AFTS, 184V, L10FIRV, K20MR, L24I, V32I, M36I, 154V, A71VT, G73AS, V77I, L90M, N88D, 147V.

Uma única mutação pode resultar em diferentes graus de sensibilidade viral ao quimioterápico. A mutação na posição 184, com substituição de metionina por valina, resulta em decréscimo de cerca de mil vezes na sensibilidade ao 3TC (alto nível de resistência) e de quatro a oito vezes ao ddI e ao ddC (baixo nível de resistência).

Trabalhos desenvolvidos por alguns pesquisadores têm evidenciado que o desenvolvimento de mutações associadas à resistência viral à zidovudina segue um padrão transitório: a mutação pode ocorrer primeiro em qualquer códon, enquanto mutações adicionais acumulam-se lenta e progressivamente durante a terapia. Outros pesquisadores têm observado, entretanto, que a resistência do HIV-1 à zidovudina desenvolve-se de forma ordenada: em indivíduos assintomáticos em tratamento com zidovudina, a mutação no códon 70 ocorre primeiro, mas é substituída pela mutação, mais estável, no códon 215. Com o tratamento prolongado, outras mutações nos códons 41, 67 e novamente 70 desenvolvem-se, conferindo ao HIV maior resistência à zidovudina. Isso ocorre apenas com a progressão da doença, uma vez que vírus altamente resistentes não têm sido isolados de amostras biológicas de indivíduos assintomáticos.

Vários métodos laboratoriais têm sido utilizados para a detecção de mutações associadas à resistência à zidovudina, incluindo-se técnicas de clivagem por RNAse e sistemas de hibridização RNA/RNA. Porém, a maioria dos estudos faz uso de métodos fundamentados na reação em cadeia da polimerase (PCR), na qual o segmento do genoma do HIV-1, codificando para transcriptase reversa e protease, é amplificado e utilizado em uma segunda reação, empregando-se pares de primers especificamente definidos para a amplificação de seqüências de mutantes ou selvagens em códons de interesse.

Os segmentos amplificados por PCR são seqüenciados diretamente utilizando-se seqüenciadores fluorescentes automatizados. Outro método para a análise genotípica consiste no ensaio de hibridização com sondas (LIPA), que se baseia na detecção de um sinal colorimétrico não-radioativo, emitido pela hibridização do produto de PCR do HIV-1 com sondas oligonucleotídicas, imobilizadas em fitas de nitrocelulose. Entretanto, uma restrição ao seu emprego são polimorfismos muito próximos, que dificultam a hibridização, impedindo a obtenção de resultados.

Genotipagem para HIV Genotipagem para HIV Reviewed by Kembolle Amilkar on sábado, novembro 08, 2008 Rating: 5

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